文章來源：浙大醫(yī)學(xué)院   2020年12月28日

肝細(xì)胞癌是最常見的原發(fā)性肝癌,，在全球范圍內(nèi),，其發(fā)病率位于惡性腫瘤的第六位，其病死率在腫瘤相關(guān)死亡原因中的排名第四,。對于晚期肝癌,，索拉非尼是首個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)的靶向治療肝細(xì)胞肝癌的藥物，既往研究表明,，索拉非尼可以有效延長晚期肝細(xì)胞肝癌患者的中位總生存期,。但是，往往在治療6個(gè)月后,，許多肝細(xì)胞肝癌患者會(huì)發(fā)生索拉非尼耐藥,，進(jìn)而出現(xiàn)進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，使下一步治療變得非常棘手,。

近日,，來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院的蔡秀軍教授團(tuán)隊(duì)在肝癌靶向治療耐藥領(lǐng)域獲突破性進(jìn)展，在Nature出版集團(tuán)旗下權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》（中國科技期刊卓越行動(dòng)計(jì)劃領(lǐng)軍期刊,，IF=13.493）上發(fā)表了題為“CircRNA-SORE mediates sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma by stabilizing YBX1”的研究,，闡明了circRNA-SORE (a circular RNA upregulated in sorafenib-resistant HCC cells）在肝癌索拉非尼耐藥中的重要作用和作用機(jī)制,。

圖1. 機(jī)制闡述

研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)circRNA-SORE表達(dá)水平在耐藥肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株中顯著升高，而抑制其表達(dá)可以顯著增強(qiáng)索拉非尼對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),，circRNA-SORE通過結(jié)合YBX1蛋白，將其相對穩(wěn)定在細(xì)胞質(zhì)中,，從而減少YBX1在細(xì)胞核中由PRP19介導(dǎo)的泛素化降解,。更重要的是，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)circRNA-SORE可以通過外泌體在細(xì)胞間傳播,，介導(dǎo)非耐藥細(xì)胞獲得耐藥性,。這一發(fā)現(xiàn)不僅為肝細(xì)胞肝癌靶向治療耐藥的干預(yù)靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)，更提供了預(yù)判耐藥人群較穩(wěn)定的生物標(biāo)志物,，有望在今后的臨床實(shí)踐中得到更廣泛的應(yīng)用,。

圖2. circRNA-SORE在索拉非尼耐藥的肝細(xì)胞肝癌中明顯升高，并且在耐藥的發(fā)生中發(fā)揮重要意義

研究團(tuán)隊(duì)首先建立了索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞系,，并通過circRNA芯片,、后續(xù)鑒定分析鎖定了在耐藥株中高表達(dá)且扮演重要角色的circRNA_104797，并將其命名為circRNA-SORE,。讓研究小組眼前一亮的是,，無論從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞數(shù)量,、細(xì)胞活力還是克隆形成能力來看，敲減circRNA-SORE均可極大程度地增加索拉非尼對肝細(xì)胞肝癌的抑制作用,，而這種“增敏效應(yīng)”在耐藥細(xì)胞株中尤為突出,，而野生細(xì)胞株卻并不顯著。

圖3. circRNA-SORE通過結(jié)合YBX1,，減少其在細(xì)胞核中被RPR19降解,，而促進(jìn)肝癌索拉非尼耐藥

那么，如此重要的circRNA究竟通過什么機(jī)制參與了肝癌的索拉非尼耐藥,？研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定了179種與circRNA-SORE特異性結(jié)合的蛋白,，同時(shí)也分別鑒定了敲減circRNA-SORE 后129個(gè)上調(diào)蛋白和301個(gè)下調(diào)蛋白。綜合分析兩組質(zhì)譜數(shù)據(jù),，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)YBX1蛋白與circRNA-SORE結(jié)合,，且在敲減circRNA-SORE之后顯著下調(diào)。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步挖掘了兩者的結(jié)合位點(diǎn),，并采用突變表達(dá),、嗎啉反義寡核苷酸阻斷、共聚焦成像以及一系列免疫共沉淀試驗(yàn)得到驗(yàn)證。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)分析提示,，circRNA-SORE可通過增加YBX1而促進(jìn)耐藥的形成,，而敲減circRNA-SORE能顯著增加YBX1的降解。

人體內(nèi)蛋白質(zhì)降解的途徑有多種,，比如溶酶體途徑,、泛素-蛋白酶體途徑以及caspase(半胱天冬酶)降解途徑。那么,，一個(gè)環(huán)狀RNA究竟是如何增加YBX1蛋白的降解呢,？這個(gè)問題困擾研究團(tuán)隊(duì)許久，直到在敲減circRNA-SORE后與YBX1結(jié)合的蛋白譜發(fā)生了細(xì)微差異,，研究團(tuán)隊(duì)敏銳地觀察到了這一現(xiàn)象并設(shè)計(jì)嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,，答案逐漸浮出水面。在敲減circRNA-SORE時(shí),，PRP19與YBX1的作用增加,，PRP19作為E3酶增加YBX1的泛素化，繼而促進(jìn)其降解,。進(jìn)一步研究驚喜地發(fā)現(xiàn),，主要位于胞質(zhì)內(nèi)的circRNA-SORE可以通過與YBX1相結(jié)合而降低YBX1的入核比例，進(jìn)而減少YBX1被PRP19作用而降解,。

圖4. 體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circRNA-SORE可通過外泌體在細(xì)胞間傳遞索拉非尼耐藥性,，敲減circRNA-SORE可以顯著使肝癌對索拉非尼增敏

肝癌是異質(zhì)性非常強(qiáng)的惡性腫瘤，不同腫瘤細(xì)胞對藥物的反應(yīng)也不盡相同,，肝癌靶向治療耐藥的過程也不會(huì)是一個(gè)同步的過程。首批獲得耐藥性的腫瘤細(xì)胞是否有可能將其耐藥性通過細(xì)胞間溝通的方式（如外泌體）向敏感的腫瘤細(xì)胞傳播而導(dǎo)致群體性耐藥呢,？帶著這個(gè)猜想,，研究團(tuán)隊(duì)嘗試從使用索拉非尼的臨床患者血清外泌體中尋找答案。結(jié)果顯示,，對索拉非尼應(yīng)答較差的患者在血清外泌體中存在更高水平的circRNA-SORE,。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，耐藥細(xì)胞分泌的外泌體中含有比野生細(xì)胞更多的circRNA-SORE,，在高表達(dá)circRNA-SORE外泌體的治療下,，野生細(xì)胞中的circRNA-SORE水平增加且耐藥性也獲同步增加，這一發(fā)現(xiàn)也得到小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,。最后,，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了CDX和PDX小鼠索拉非尼耐藥模型，驗(yàn)證了前述的研究發(fā)現(xiàn),，證實(shí)了敲減circRNA-SORE可增加索拉非尼對腫瘤的抑制并降低YBX1 的水平,。

 

該成果的3點(diǎn)重要?jiǎng)?chuàng)新發(fā)現(xiàn)：

（1）首次鑒定了在肝癌索拉非尼耐藥中具有關(guān)鍵作用的circRNA-SORE；

（2）首次揭示了PRP19對YBX1的促泛素化和降解作用；

（3）首次發(fā)現(xiàn)外泌體-circRNA-SORE介導(dǎo)的肝癌索拉非尼耐藥性的細(xì)胞間傳播,。

 

綜上,，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)circRNA-SORE在索拉非尼耐藥形成過程中發(fā)揮了重要的作用。本研究設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn),、思路新穎,，為肝細(xì)胞肝癌的臨床診療提供了新的思路。蔡秀軍教授是論文的通訊作者,，徐俊杰博士后為論文的第一作者,。該項(xiàng)研究受到國家重大科研項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,、浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃,、中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目等資助。